客户文章磷酸化蛋白质组学揭示达沙替尼

编者按：

慢性胰腺炎（chronicpancreatitis,CP）是胰腺的一种进行性炎症性疾病，会导致腺体萎缩和纤维化且不可逆。目前，CP的临床药物治疗方案主要是胰酶替代，血糖控制和营养支持治疗等，缺乏针对胰腺纤维化治疗的特定药物。CP病因复杂并且仍然不清楚，以往研究发现，其与胰腺星状细胞（PSCs）的过度活化、巨噬细胞的极化相关。达沙替尼（Dasatinib）是一种口服多靶点受体酪氨酸激酶（RTKs）抑制剂，已被证实在各种纤维性疾病如系统性硬化，肺和肝纤维化中表现出抗纤维化作用，然而，达沙替尼对CP的影响尚未得到评估。

医院的王丽娟老师系统地研究了达沙替尼在雨蛙素诱导的小鼠CP模型、培养的PSCs细胞和巨噬细胞中对胰腺纤维化和炎症的影响，发现达沙替尼显著改善了CP小鼠模型中的胰腺纤维化和巨噬细胞的浸润。进一步的转录组、磷酸化蛋白质组和体外验证实验表明，达沙替尼通过TKs/GSK3β/β-catenin途径对PSCs的增殖和活化发挥显著抑制作用。此外，达沙替尼显著抑制了巨噬细胞的M1和M2极化，并改善了其与PSC的细胞间通讯。总之，作者认为达沙替尼可能是一种潜在的CP治疗药物。研究成果发表于PharmacologicalResearch（IF=5.）。值得一提的是，该研究中的磷酸化修饰蛋白质组学检测和分析由诺禾致源提供，质谱平台为QExactive?HF-X。

方法流程

研究结果

1.达沙替尼在体内改善了雨蛙素诱导的胰腺炎症和纤维化首先，研究者构建了雨蛙素（Cae）诱导的CP小鼠模型（图1A），3组6重复（正常组control，疾病组Cae，用药组Cae+Dasa）。随后，针对小鼠体重（图1B）、胰腺体重（图1C）、生理指标进行统计检测（图1D）；通过病理组织染色（图1E）、免疫组化进行形态观察（图1F）；同时针对胰腺纤维化和炎症因子基因标志物进行qPCR检测（图1G）。数据表明：达沙替尼治疗可以显著改善体内雨蛙素诱导的CP的严重程度，并推断这可能是通过抑制PSCs的活化和巨噬细胞的浸润和招募来实现的。图1达沙替尼在体内改善了雨蛙素诱导的慢性胰腺炎的严重程度2.达沙替尼抑制HPSCs的增殖、迁移、活化

体外实验，评估达沙替尼对培养的人类胰腺星状细胞（HPSCs）的增殖、凋亡、活化的影响。WB实验发现，达沙替尼处理后细胞增殖标志物PCNA、死亡抑制因子Bcl-2显著降低，凋亡激动剂Bax升高（图2A），表明达沙替尼治疗可抑制HPSCs的增殖，同时促进其凋亡。划痕伤口愈合测定和transwell迁移测定，进一步证实达沙替尼显著抑制HPSCs的细胞迁移。

针对α-SMA（α-Smoothmuscleactin），Ⅰ型胶原α1（Col1α1）和纤粘蛋白在内的PSC活化标志物进行WB和qPCR检测（图2A和D），达沙替尼降低了这些纤维化基因在蛋白质和mRNA水平上的表达。表明达沙替尼显著抑制了HPSCs的活化和纤维蛋白原/胞外基质蛋白的产生。

图2达沙替尼抑制HPSCs的增殖，迁移和活化

3.RNA-seq和磷酸化蛋白质组学分析探究达沙替尼对PSCs的功能机制

针对达沙替尼（60nM，4小时）处理或非处理的HPSCs进行RNA-seq和磷酸化蛋白质组学分析。转录组与磷酸化蛋白质组数据表明达沙替尼可能通过Src，MAPK和GSK3信号通路对HPSCs活化起抑制作用。后续对一系列酪氨酸激酶，GSK3β通路进行WB验证。研究者推测达沙替尼可能通过TKs/GSK3β/β-catenin信号通路对HPSCs的激活起抑制作用，从而抑制下游增殖和纤维化基因的表达。

图3达沙替尼抑制HPSCs活化和增殖的通路示意图

4.达沙替尼抑制巨噬细胞的极化及其与PSCs的细胞间通讯

已有报道巨噬细胞M2s在胰腺纤维化中起关键作用，所以研究者探究了达沙替尼对巨噬细胞体外培养M1/M2极化的影响。极化相关基因qPCR与WB结果显示达沙替尼显著抑制M1和M2极化。达沙替尼不仅抑制PSC的活化以及巨噬细胞的M1和M2极化，而且还通过抑制分泌细胞因子如IL-4，IL-13的表达来中断PSC和巨噬细胞之间的通讯。

图4达沙替尼调节PSCs和巨噬细胞之间通讯的通路示意图

小编总结

本研究中研究者首先在体内与体外两个层次采用多种方法评估了达沙替尼对胰腺纤维化和炎症的治疗作用，评估方法系统而全面；随后，采用转录组与磷酸化修饰蛋白质组多组学关联快速锁定药物作用机制，技术手段新颖且有效；辅以WB，qPCR验证，研究方法完善，数据有说服力。系统证明达沙替尼可能是治疗CP患者的潜在治疗药物，MAPK/GSK3β/β-catenin途径可能是一个很有前景的治疗靶点。

参考文献：

Dasatinibameliorateschronicpancreatitisinducedbycaeruleinviaanti-fibroticandanti-inflammatorymechanism,.:.

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