一种治疗慢性胰腺炎神经性疼痛的新方法nN

王丽娟邹文斌审校

如何缓解慢性胰腺炎或胰腺癌引起的疼痛是临床治疗的一个难题。尽管有内镜技术或手术治疗，大多数患者仍会出现疼痛复发或依赖阿片类止痛药物。因此，迫切需要探索胰腺疾病疼痛的分子机制并寻找止痛的新靶点。

本研究的理论基础：慢性胰腺炎（CP）和胰腺癌（PCa）的神经重塑和疼痛感受神经肽的分布。胰腺由来自后根神经节（胸8-11）的传入（感觉）神经纤维（红色）和来自中间外侧核神经元的传出（交感）神经纤维（蓝色）所支配。这些神经纤维先在内脏神经中汇合，然后汇入腹腔神经节，进入胰腺（图1a左）。既往研究发现CP和PCa中交感神经纤维数量是减少的，这一现象引发了研究者思考一个问题，即痛觉神经纤维数量是否增加了（图1a右）？

对CP、PCa和正常胰腺（NP）的手术切除组织样本中的神经进行免疫染色标记，包括胰腺神经标记物PGP9.5，4种伤害感受相关的神经肽：P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）、血管活性肠肽（VIP）和神经型一氧化氮合酶（nNOS），并将神经肽免疫染色阳性区域与神经面积之比表示为“%neuroimmunoreactivity”。实验结果发现，与NP相比，CP和PCa组织样本中神经肽SP和VIP的含量无明显差异；但与NP和CP相比，PCa组织样本中CGRP和nNOS的含量明显减少（图1b）。

将CP患者的疼痛程度（0、I、II度）与胰腺中神经肽的含量进行关联分析，可见II度疼痛时，神经中nNOS的含量相对增多，而神经中SP、CGRP和VIP的含量与CP疼痛程度无明显关系（图2a）。

神经炎症被认为是消化道内脏神经性疼痛的主要因素。在CP和PCa中，神经炎症是常见的，且与疼痛程度相关。将神经炎症的程度：无炎症（0）、中度（I度）、重度（II度）炎症与胰腺中神经肽的含量进行关联分析，可见I、II度神经炎症时，nNOS的含量是相对增加的（图2b）。

此外，将PCa患者的疼痛程度（0、I、II度）与胰腺中神经肽的含量进行关联分析，可见4种神经肽的含量与疼痛程度无明显关系（图3a）。

将PCa中神经炎症的程度（0、I、II度）与神经肽的含量进行关联分析，可见II度神经炎症时，4种神经肽的含量均显著减少（图3b）。

总的来说，本研究发现神经肽nNOS在CP中特异性增多，且与疼痛程度和神经炎症的程度有关。为了探索nNOS在疼痛性CP中增多的机制，研究者进行了体外neuroplasticity实验：用人类NP、CP或PCa组织提取物刺激小鼠背根神经节（DRG）神经元，并量化神经突的密度。当用抗体中和CP组织提取物中的脑源性神经营养因子（BDNF）时，DRG中含有nNOS的氮能神经纤维数量相对增多；当向CP组织提取物中添加重组人BDNF（rhBDNF）时，DRG中含有nNOS的氮能神经纤维数量相对减少。而用抗体中和CP组织提取物中的神经营养因子3（NT-3）并没有影响氮能神经纤维的数量（图4a）。

为进一步验证BDNF与nNOS的拮抗性关系，研究者观察了BDNF+/-小鼠（杂合敲除基因BDNF）。可见与WT小鼠相比，BDNF+/-小鼠胰腺神经中nNOS的含量明显增多（图4b）。此外，qPCR实验显示，与NP相比，CP患者胰腺组织中BDNF的转录表达是显著降低的（图4b）。综上所述，这些实验结果表明CP病程中BDNF的下调促进了疼痛感受相关的氮能神经纤维数目的增多。

除了BDNF的下调可以促进神经肽nNOS增多外，肥大细胞也可以影响nNOS的含量。研究者发现在疼痛性CP患者的胰腺神经周围聚集了大量的肥大细胞。在体外DRG培养基中添加不同浓度的肥大细胞类胰蛋白酶，可见神经中nNOS的表达量增加了，这表明肥大细胞也可以促进nNOS的表达（图4b）。

为了验证PCa胰腺组织中氮能神经的分布，研究者在体外DRG培养基中添加KPC小鼠肿瘤细胞的上清液，结果可见DRG中nNOS+神经纤维数目明显减少（图5a-b）。这与KPC小鼠胰腺组织中nNOS+神经纤维数目较少相一致。此外，因为KC小鼠胰腺中nNOS+神经纤维数目介于KPC小鼠和正常小鼠之间，提示神经肽nNOS在PCa病程中是逐渐减少的（图5c）。[注：LSL-KrasG12D,Trp53fl/fl,p48-cre（简称KPC小鼠）、LSL-KrasG12D,p48-cre（简称KC小鼠）]

接下来，研究者测定了CP小鼠模型中nNOS+神经纤维的含量。使用了两种CP模型。其一，基因工程CP小鼠：胰腺组织特异性敲除基因Atg5，即Atg5Δ/Δpan小鼠，在18周龄时表现出胰腺萎缩，但无明显疼痛症状。其二，雨蛙素造模CP小鼠：反复腹腔注射雨蛙素，剂量为50μg/kg，每周给药3天，每天6次（给药间隔为1h），时长共8周，小鼠表现出明显的疼痛症状。在Atg5Δ/Δpan小鼠胰腺组织中nNOS+神经纤维的数量与WT小鼠相比无明显差异（图5c-d）。

在雨蛙素诱导的CP小鼠胰腺组织中，nNOS+神经纤维的数量与小鼠腹痛的程度相关，疼痛刺激vonFrey评分高的小鼠中nNOS+神经纤维的数量显著增多（图6a）。

基于CP患者和雨蛙素CP小鼠胰腺组织中疼痛相关神经肽nNOS的特异性上调，研究者思考nNOS可否作为治疗CP疼痛的一个靶点。于是，研究人员接下来使用特异性的nNOS抑制剂NPLA处理CP小鼠，图6b可见NPLA明显下调了雨蛙素小鼠的vonFrey评分，减轻了小鼠腹痛。但对Atg5Δ/Δpan小鼠和PCa小鼠的vonFrey评分无明显影响。这说明nNOS可作为一个治疗CP疼痛的新靶点（图6c）。

从该研究可见CP和PCa的疼痛机制可能是有差异的，因为nNOS+神经纤维的数量在疼痛性CP中特异性增多，但在PCa中是明显减少的。此外，nNOS引起疼痛的具体分子机制可在本研究原文的讨论部分和参考文献中查询。目前，止痛药、内镜和外科手术是临床治疗CP患者疼痛的主要手段。本研究针对CP疼痛的发病机制，尝试使用nNOS抑制剂靶向治疗CP疼痛，为CP临床治疗和止痛提供了一种新思路和新选择。

参考文献：

DemirIE,HeinrichT,CartyDG,etal.TargetingnNOSamelioratesthesevereneuropathicpainduetochronicpancreatitis[J].EBioMedicine,,46:-

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